前 言
本标准的附录A、附录B为规范性附录，附录C为资料性附录。
本标准由黑龙江省畜牧局提出。
本标准由黑龙江省畜牧标准化委员会归口。
本标准起草单位：黑龙江省家畜繁育指导站。
本标准主要起草人：丁可为、郝爱玲、聂德宝、阿淑艳。
牛冷冻精液生产技术操作规程
1 范围
本标准规定了牛冷冻精液生产的术语和定义、器械清洗和消毒、稀释液配制、采精、精液处理、精液冷冻、冻精解冻、冻精活力检查和检验规则、包装、贮存及运输。
本标准适用于牛冷冻精液生产。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 4143 牛冷冻精液
GB/T 5458 液氮生物容器
3 术语和定义
本标准采用下列定义。
3.1
种公牛（ Bull Kept for Covering ）
符合本品种种用标准一级以上的公牛。
3.2
采精 （Semen Collection）
用人工模拟且有自然交配感的工具，以获得公牛精液的方法。
3.3
台牛（Teaser Female）
能引诱公牛性欲、勃起、以供其爬跨的同种动物。
3.4
假阴道（Artificial Vagina）
模拟母牛阴道环境条件的人工采精工具。由外壳、内胎、漏斗、集精管等组成。
3.5
射精（Ejaculation）
公牛经性反射最终从阴茎射出混合液的过程。
3.6
射精量（Volume Per Ejaculate）
公牛一次采精或交配时排出的精液量。
3.7
精液（Semen）
由精子和精清两部分组成的雄性生殖器外分泌物。精子悬浮在液状的精清中。
3.8
精子（Sperm）
一种高度特化的雄性配子，具有活动能力，含有遗传物质。由头、颈、尾三部分组成。
3.9
精清（ Seminal Plasma）
射精时随精子一起射出的液体介质。其主要作用为从雄性生殖道传递精子的运载工具。
3.10
精液检查 (Semen Examination)
鉴别精液质量的主要手段。
3.11
精液稀释液（Semen Dilutor）
保护精子延长其存活时间及增加精液容量的液体。
3.12
细管冻精(Straw Frozen Semen)
精液冷冻类型之一。将精液用稀释液等温稀释、降温、平衡后，分装入细管并封口，然后在液氮中快速冷冻。
3.13
精液贮存(Semen Storage )
精液处理后至用于配种前需要保存的方法。
3.14
精液解冻(Thawing Frozen Semen)
冷冻精液使用（输精）前的处理方法。
3.15
冷冻精液(Frozen Semen)
经特殊方法处理的精液超低温冷冻后在液氮中（-196℃）长期保存。
3.16
检验(Inspection)
对产品或服务的一种或多种特性进行测量、检查、试验、度量，并将这些特性与规定的要求进行比较，以确定其符合性的活动。
4 器械清洗和消毒
4.1 玻璃器皿的清洗和消毒
玻璃器皿使用后或新购置的玻璃璃器皿，都要用自来水先浸泡。洗涤时，先在加有洗涤剂的温热溶液中进行刷试，如果遇到有污物或油垢不易清洗的，应先放入重铬酸钾洗液中浸泡数小时，然后再用水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗两遍，直至器皿光亮、无水滴附着为止。将洗净的玻璃器皿放入电热干燥箱，加热至160℃后恒温1h，自然冷却后待用。
4.2 假阴道的清洗
假阴道使用后，用水冲去表面污物，然后在加有洗涤剂的温热溶液中用长毛刷刷洗，并用水冲洗干净，再用蒸馏水逐个冲洗。将洗净的假阴道放在架子上，其上覆盖两层清洁纱布，晾干备用。如发现内胎漏气、漏水或皱折，应及时更换或整理。
4.3 其它器械的消毒
制作冷冻精液所用的器械事先要进行消毒。竹夹、瓷漏斗、金属镊子、药匙、胶塞和吸管胶头等都用75%的酒精棉球擦试消毒，注意凡是用酒精消毒过的器械，必须待酒精挥发尽后方能使用，细管用冷冻架使用前用紫外线清毒30min 。
4.4 载玻片和盖玻片的清洗
检查精液的载玻片和盖玻片，用后应立即浸泡于水中，清洗后用柔软的布擦试干净备用。
4.5 纱布的清洗消毒
生产用的纱要定期进行清洗、消毒。塑料细管、细管包装用塑料管及纱布袋用紫外线消毒30min后方可使用。
5 稀释液配制
5.1 稀释液配方
参见附录C。
5.2 稀释液配制方法
5.2.1 蒸馏水的制备
配制稀释液应使用双蒸水，双蒸水可用玻璃蒸馏器烧制，严格按照仪器的说明书进行操作。
5.2.2 天平的使用
天平应放置在平稳的工作台上，保持清洁干燥，称取药品时，盘内垫以称量纸，校零后方可称量。提倡使用精度高的电子天平，并要严格按照使用说明进行操作。
5.2.3 药品的称取及保存
化学药品称量取用后，应立即将瓶口盖严，以免灰尘、杂菌等污染，防止分解和潮解。特别是甘油具有很强的吸水性，如保管不当，将会影响用量的准确性。药匙应一对一使用，药量必须精确。
5.2.4 卵黄的取用
鸡蛋应来源于无疫病的鸡场，且所用鸡蛋须新鲜、完整、干净，取卵黄前先用75%酒精棉球对蛋壳表面进行消毒，待酒精挥发尽后用蛋清分离器取出完整的卵黄；也可在鸡蛋腰中线外敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒，除去蛋清，留下卵黄；然后用灭菌的注射器穿过卵黄膜抽取卵黄。
5.2.5 稀释液的配制程序
配制12%蔗糖溶液100mL：先准确称取蔗糖（分析纯）12g，放入容量为100mL的量筒内，加入蒸馏水50mL左右，用消毒过的玻棒搅拌，等蔗糖溶解后再加蒸馏水至100mL，混匀后用滤纸过滤于三角烧瓶中，扎好（塞紧）瓶口，置75℃水浴锅中消毒30min。
取冷却后的蔗糖溶液75mL、甘油5mL、卵黄20mL和青、链霉素各（5～10）万单位加入三角烧瓶中，用磁力搅拌器充分搅拌均匀后放入3℃～5℃的冰箱内待用，但放置时间不得超过24h。
6 采精
6.1 种公牛的要求
6.1.1 种公牛应符合附录B.1的规定。
6.1.2 采精前种公牛体表及包皮内腔应冲洗干净。
6.2 采精准备
6.2.1 采精场所的要求
采精场应保持宽敞、安静，地面保持清洁卫生并铺以防滑设施，如橡胶板等，以免公牛采精时滑倒。
6.2.2 台牛的准备
选择健壮、性情温顺、无疫病的母牛或公牛做台牛，并保定于采精架内。台牛的外阴、臀部应冲洗干净。
6.2.3 仪器设备的准备
预先使恒温箱和水浴锅处于33℃～35℃工作状态，将采精用具有规则地摆放在操作台上，假阴道润滑剂（凡士林与液体石蜡油按1：1的比例调制）用水浴消毒。
6.2.4 假阴道的准备
安装假阴道前应先洗净双手，用75%的酒精棉球消毒假阴道内胎及三角漏斗，将三角漏斗安装于假阴道上，再按上集精管，套上保护套，假阴道内可提前注入38℃左右的温水，并用消毒纱布将假阴道口包裹好，放置于预先调整好温度（44℃～46℃）的恒温箱内待用。青年牛用光面内胎的假阴道，成年牛可用纹状面内胎的假阴道。采精前在假阴道内胎的前三分之二处用涂抹棒均匀擦适量消毒过的润滑剂，并从活塞孔打气，使假阴道有适度（假阴道口呈三角形状为宜）的压力。采精时温度控制在38℃～40℃之间，根据不同的牛，温度可做适当调整，最高不得超过43℃。
6.3 采精方法
采精时饲养员与采精员要积极配合。采精员的动作要迅速而正确，胆大心细，注意人畜安全。采精前先进行数次空爬使之有充分的性准备，待公牛性欲旺盛时采精。为提高公牛的性欲可采取：空爬、抑制爬跨、更换台牛、更换地点、观摩、引诱、被爬跨、按摩等措施。采精员右手持假阴道，站在公牛右后方，当公牛起跳，前肢爬上台牛时，迅速向前用左手托着公牛包皮，右手持假阴道与台牛成40度角，假阴道口斜向下方，左右手配合将公牛阴茎自然地引入假阴道口内（不得用手捉拿阴茎、假阴道套阴茎），假阴道条件适宜，公牛往前一冲即完成射精动作，公牛随即而下，此时，采精员右手紧握假阴道，随公牛阴茎而下，待公牛前肢落地时，缓慢地把假阴道脱出，立即将假阴道口斜向上方，打开活塞放气，使精液尽快地流入集精管内，然后小心地取集精管，迅速转移至精液处理室。安装好的假阴道只能使用一次，不得重复使用。成年公牛每周采精两次，每次可连续采精两回，间隔时间30min左右。
6.4 采精后的处理
采精后应及时清扫场地并用水冲洗干净。假阴道等采精器械清洗干净后应尽快消毒。
7 精液处理
7.1 准备
凡是接触精液的器皿均应放在33℃～35℃恒温箱中，稀释液放在34℃恒温水浴箱中备用。稀释用玻璃器材应置34℃恒温箱中，稀释时只能将稀释液往精液里加，不可逆行操作。盛装稀释精液的稀释管，应做明显标记，以防混淆。
7.2 密度测定
采集的精液通过专用窗口传递入精液处理室后，按精液密度测定仪的操作规程准确进行精液的密度测定。所有仪器必须精确，操作必须正确。
测出密度后通过计算或精液密度测定仪的相关程序获得应加稀释液量、可制作细管数等信息。并及时记录牛号、采精量、密度、所加稀释液量、制作细管数等有关数据。
7.3 鲜精镜检
取精液或稀释精液一滴于载玻片上，加盖盖玻片后在38℃恒温装置的相差显微镜上评定活力，活力用百分率表示，例如80%或0.8。活力是判断精液质量的一个重要指标，镜检活力等项指标应符合附录B中的B.2.1的规定,合格后方可进行稀释。
7.4 稀释、封装、平衡和标志
7.4.1 使有一种稀释液
取一支盛有30mL稀释液经34℃水浴预先加温的试管，对精液进行稀释，在34℃水浴中暂存10 min后加稀释液到最后稀释量。
a)方法一：再过10min后即可在20℃以下常温实验室操作台上进行精液分装，分装后的细管精液放入不透明的塑料盒内，每盒以盛放300支为宜（遇一头牛的细管数量较大应分放在二个塑料盒中），把塑料盒放入4℃冷藏柜中平衡3h～4h。并在低温柜上盖一条毛巾，避免强光进入低温柜内；
b)方法二：加完稀释液后，用水杯盛适量的34℃水，把稀释管放入后送4℃低温柜内降温平衡，2h后水杯中加冰块促使其快速降温至4℃（空细管也应降至4℃），再在低温柜中进行细管分装。分装后的细管即可进行冷冻。
7.4.2 使用两种稀释液
用34℃的第一液缓慢地加入精液中，摇匀，所加第一液的量=[（所加稀释液总量+精液量）/2]-精液量，用烧杯盛适量的34℃水，把稀释管放入后送4℃低温柜内降温，与此同时把第二液也放入4℃低温柜。平衡2h后水杯中加冰块促使其快速降温。当降温至10℃时加入第二液，所加第二液的量=（所加稀释液总量-所加第一液的量）。加入第二液以后再平衡30min 以上才能在低温柜中进行细管分装（空细管也应降至4℃），分装后的细管即可进行冷冻。
有条件的单位可使用细管一体机进行分装操作，这是一套在完成灌装与封口后即刻进行喷墨印字的一体化设备，它使得人们在储精细管未装精液封口前不必触动它，以便在尽可能不被外界污染的情况下完成细管精液的灌装与封闭，这对减少环境污染、提高产品的卫生质量指标极为有利。
细管上所印的信息必须符合牛冷冻精液国家标准要求，字迹清晰易认。详细信息见附录A。
8 精液冷冻
8.1 上架
平衡、封装后的细管精液上架码放是应注意细管摆放方向，把棉塞封口端靠近操作者，超声波封口端远离操作者，入冷冻仪时亦应如此放置。每架上放上根类似于细管的标记物，一头牛用同一颜色的标记物，便于识别。如同一架上有不同牛的细管精液，要分开码放，两头牛之间要隔开一些距离，以免混淆。
8.2 冷冻
8.2.1 全自动冷冻仪
冷冻仪是由电子计算机控制的全自动冷冻容器，可根据使用者的需要获取多条冷冻曲线。使用时首先在电脑中设置好冷冻的最佳温度曲线，冷冻仪与低温柜应尽量靠近，开启液氮罐阀门把冷冻仪降温4℃，关闭风扇电源，待风扇完全停止后把已排满待冻细管的架子迅速放入冷冻仪，盖严盖子按电脑预先设定好的最佳冷冻曲线程序自动完成冷冻过程。如果冻精细管数量不足时，要填充备用塑料管和细管架以保持最佳冷冻曲线程序自动完成冷冻过程，确保冻精质量。
8.2.2 大口径液氮罐
a)液氮生物容器（液氮罐）应符合GB/T5458的规定；
b)液氮罐温度调控主要起决于是冷冻架离液面的距离和一次冷冻的细管数（即冷冻架的多少），冷冻的温度一般控制在-140℃左右，初冻温度调至-120℃左右，冷冻时温度回升的最高值不得高于-90℃，整个冷冻过程控制在8min之内，此间所指的冷冻温度是细管冷冻面的温度而非细管内的温度。
8.2.3 自制的冷冻箱
用自制的冷冻箱冷冻细管时，冷冻箱的深度应在50cm以上，所调控的温度值同8.2.2。
8.3 收集
冷冻完成后，打开冷冻容器盖子，冻精按牛号投入盛满液氮的不同提筒中，细管的超声波封口端在上，棉塞封口端在下，不得倒置，以免细管棉塞端的爆脱，并迅速浸泡在液氮中。
9 冻精解冻
预先把水浴箱水温加热至38℃～40℃，用镊子取一支冷冻后的细管精液迅速浸泡入38℃～40℃水中晃动，待完全溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细管剪先剪去超声波封口端，再剪去棉塞端将细管内的精液全部置于一小试管内混均匀后，取一滴精液于载玻上并盖上盖玻片即可检查，并进行全面评定。
10 冻精镜检和检验规则
10.1 冻精镜检
镜检所用器材设备同7.3,解冻和检查方法同9，镜检不合格者应立即废弃；镜检合格后方可进行包装。
10.2 检验规则
a)冻精产品的质量应由相对独立的技术人员负责检测与监督，出站前外观、精子活力每头每批号的产品必须检验，经质检员检验合格并出具合格证后，才可作为合格品支付；
b)每季度每头公牛的冻精产品型式检验不少于一次；
c)当生产冻精的重要原材料、器件等有重大改变影响到产品质量时必须做型式检验。
11 精液包装
用细管计数分装机进行包装，包装应在-140℃以下的环境中进行，包装后的细管其棉塞端在塑料管的底部，不得倒置。塑料包装管的内径应均匀一致，不得用上口大、底部小的塑料管。包装好的细管精液入贮存库。
不同品种公牛的冻精，可用不同颜色包装加以区别；其包装颜色和公牛品种代号按牛冷冻精液国家标准实施。
12 冻精贮存
12.1 冻精应贮存于液氮罐的液氮中，贮存冻精的低温容器应符合GB/T5458标准规定。
12.2 设专人保管，每周定时加一次液氮，保证冻精始终浸在液氮中。
冻精保管人员应经常检查液氮罐的状况，如发现液氮罐外壳结白霜，立即将精液转移入其它液氮罐内保存。包装好的冻精由一个液氮罐转换到另一液氮罐时，在液氮罐外停留时间不得超过3s。取存冻精后要盖好液氮罐塞，在取放盖塞时，要垂直轻拿轻放，不得用力过猛，防止液氮罐塞折断或损坏。移动液氮罐时，不得在地上拖行，应提握液氮罐手柄抬起罐体后再移动，要轻拿轻放，严禁震荡、撞击。且置于阴暗处，并注意室内通风。
12.3 每头公牛的冻精应单独贮存。
12.4 贮存冻精的容器每年至少清洗一次并更换新鲜液氮。
13 冻精运输
13.1 冻精运输过程中要有专人负责，贮存容器不得横倒及碰撞昨强烈振动。
13.2 保证冻精始终浸在液氮中。
附 录 A
（规范性附录）
细管冷冻精液标记方法
细管冷冻精液标记由十六位数四部分组成，排列顺序如下：
a)第一部分：公牛站代号三位数；
b)第二部分：品种代号二位数；
c)第三部分：冻精生产日期六位数；
d)第四部分：公牛号五位数。
第一部分公牛站代号以全国畜牧兽医总站公布的公牛站代号为准；第二部分品种代号以GB/T4143为依据；第三部分冻精生产日期六位数按年月日次序排列，年月日各占二位数字，年度的后两位数组成年的二位数，月日不够二位的月日前分别加“0”补充为二位数。第四部分公牛号取该牛身分证号码的后五位数。部分与部分之间空一个汉字（二个字节），第一、第二部分用汉语拼音大写字母表示。标记的字迹必须清晰易认。
标记示例：
|
棉塞封口端 HLJ HS 040518 96188 超声波封口端 |
HLJ为黑龙江省家畜繁育指导站代号；
HS为荷斯坦种公牛的品种代号；
040518为2004年5月18日的生产日期代号；
96188为该公牛身份证号码HSHLJ96188的后五位数。
附 录 B
（规范性附录）
种公牛及新鲜精液质量要求
B.1 种公牛
B.1.1 使用公牛要具有种用价值，应符合本品种的特征，其评价为特等或一等标准。
B.1.2 种公牛体质健康，无传染病。
B.1.3 公牛外周血检测染色体正常、无遗传病。
B.2 公牛鲜精质量
B.2.1 种公牛新鲜精液质量应符合下列标准：
a)色泽呈乳（灰）白色或淡黄色；
b)精子活力≥65%；
c)精子密度≥6×108mL；
d)精子畸形率≤15%。
附 录 C
（资料性附录）
牛冷冻精液稀释液配方
牛冷冻精液稀释液配方如下：
第一液 蒸馏水100mL，柠檬酸钠2.9% ,卵黄10mL。
第二液 取第一液41.75mL，加入果糖2.5 g，甘油7mL。
上述稀释液，每100mL加青、链霉素各（5～10）万单位。
